La ribonucléase PNPase est un régulateur clé de la formation de biofilm chez Listeria monocytogenes et affecte l'invasion des cellules hôtes

npj Biofilms et Microbiomes volume 9, Numéro d'article : 34 (2023) Citer cet article

69 Accès

2 Altmétrique

Détails des métriques

Les biofilms fournissent un environnement qui protège les micro-organismes des stress externes tels que la privation de nutriments, les traitements antibiotiques et les défenses immunitaires, créant ainsi des conditions favorables à la survie et à la pathogenèse des bactéries. Ici, nous montrons que la protéine de liaison à l'ARN et la ribonucléase polynucléotide phosphorylase (PNPase) est un régulateur positif de la formation de biofilm chez l'agent pathogène humain Listeria monocytogenes, l'un des principaux responsables de la contamination des aliments dans les environnements de transformation des aliments. La souche mutante PNPase produit moins de biomasse de biofilm et présente une morphologie de biofilm altérée qui est plus sensible au traitement antibiotique. Grâce à des essais biochimiques et à des analyses microscopiques, nous démontrons que la PNPase est un régulateur jusque-là non reconnu de la composition de la matrice extracellulaire du biofilm, affectant considérablement les niveaux de protéines, d'ADN extracellulaire et de sucres. Il convient de noter que nous avons adapté l'utilisation du complexe fluorescent rouge de ruthénium-phénanthroline pour la détection des polysaccharides dans les biofilms de Listeria. L'analyse transcriptomique des biofilms de type sauvage et des mutants de la PNPase révèle que la PNPase impacte de nombreuses voies de régulation associées à la formation du biofilm, notamment en affectant l'expression de gènes impliqués dans le métabolisme des glucides (par exemple, lmo0096 et lmo0783, codant pour les composants PTS), des acides aminés (par exemple, lmo1984 et lmo2006, codant pour des enzymes biosynthétiques) et dans le système Agr quorum sensing-like (lmo0048- 49). De plus, nous montrons que la PNPase affecte les niveaux d'ARNm du régulateur maître de virulence PrfA et des gènes régulés par PrfA, et ces résultats pourraient aider à expliquer l'internalisation bactérienne réduite dans les cellules humaines du mutant ΔpnpA. Dans l'ensemble, ce travail démontre que la PNPase est un important régulateur post-transcriptionnel de la virulence et de l'adaptation au mode de vie du biofilm des bactéries Gram-positives et met en évidence le rôle croissant des ribonucléases en tant qu'acteurs essentiels de la pathogénicité.

Les biofilms sont le mode de croissance prédominant des micro-organismes dans les écosystèmes naturels. Cependant, ils constituent une préoccupation médicale croissante étant donné que 80 % des infections microbiennes sont associées à des biofilms1,2 et contribuent à la persistance des infections chroniques3. Les biofilms sont définis comme des communautés de micro-organismes qui sont attachés à des surfaces biotiques ou abiotiques et sont enfermés dans des substances polymères extracellulaires hydratées (EPS) autoproduites, également connues sous le nom de matrice de biofilm4,5. Les polysaccharides, les protéines, les phospholipides et les acides nucléiques sont les principaux composants de la matrice extracellulaire du biofilm6. Les micro-organismes sessiles sont protégés par la matrice environnante et peuvent supporter des stress externes comme la privation de nutriments et la dessiccation bien mieux que les bactéries planctoniques, tout en étant beaucoup moins sensibles à l'action des agents antimicrobiens et aux défenses immunitaires de l'hôte7. La structure du biofilm permet l'accumulation des composants des cellules lysées et favorise le transfert horizontal de gènes entre les bactéries et la communication cellule-cellule6,8.

La formation de biofilm a été associée à la virulence de plusieurs bactéries pathogènes en favorisant l'infection. Listeria monocytogenes (Listeria) est une bactérie pathogène à Gram positif qui cause la listériose, l'une des infections d'origine alimentaire les plus mortelles chez l'homme9. Il peut survivre intracellulairement, manipuler les machineries cellulaires de l'hôte et échapper au système immunitaire10. L. monocytogenes supporte des conditions environnementales défavorables telles que des températures basses, un pH bas et des concentrations élevées de sel11. De plus, elle peut adhérer à plusieurs types de surfaces, persister sous forme de biofilms dans les environnements de transformation alimentaire et contaminer les produits alimentaires, faisant de cette bactérie un fardeau majeur pour l'industrie alimentaire12,13,14,15. Lorsqu'ils sont cultivés dans des conditions statiques, les biofilms de L. monocytogenes peuvent soit se présenter sous la forme d'une monocouche bactérienne16, soit former un biofilm en nid d'abeille17. Ils peuvent également former des structures en forme de boule dans des conditions d'écoulement continu18.

La formation de biofilm est un processus complexe et multifactoriel. Chez L. monocytogenes, comme chez d'autres pathogènes bactériens, il a été démontré que la capacité de nage19 et le système de type Agr quorum sensing sont importants aux premiers stades de la formation du biofilm, ce dernier étant impliqué dans la régulation des protéines pertinentes pour l'adhésion aux surfaces et/ou aux bactéries20,21. De plus, le régulateur transcriptionnel de la virulence PrfA et le régulateur de la réponse au stress σB sont importants pour le développement du biofilm chez Listeria, notamment en contrôlant l'expression de gènes tels que actA, inlA et rmlA22,23,24,25. Par exemple, il a été montré que le facteur ActA régulé par PrfA est impliqué dans l'agrégation bactérienne, une étape clé dans la formation du biofilm24. PrfA est responsable de l'expression de plusieurs facteurs de virulence, tels que les protéines de surface internalines, qui sont essentielles pour l'invasion des lignées cellulaires de mammifères10,26. De plus, d'autres facteurs jouent un rôle dans la formation de biofilms chez les bactéries pathogènes, tels que les ARNs27,28 et le c-di-GMP29,30.

Un autre facteur trouvé pour réguler la formation de biofilm chez d'autres espèces bactériennes est la protéine polynucléotide phosphorylase de liaison à l'ARN (PNPase). Il s'agit d'une exoribonucléase 3'-5' hautement conservée qui catalyse la dégradation et le traitement de l'ARN31 et a été impliquée dans des processus liés à la virulence chez différentes espèces bactériennes32,33,34. Nous avions précédemment découvert que la PNPase est une enzyme importante de L. monocytogenes dans le traitement et la fonction d'un élément CRISPR35. Chez les bactéries Gram-négatives Escherichia coli K-12 et Salmonella enterica sérovar Typhimurium, il a été démontré que l'inactivation de la PNPase altère la formation de biofilm36,37,38. Cependant, dans la souche E. coli C, le mutant de suppression de la PNPase a montré une augmentation de la formation de biofilm39. Ainsi, le rôle de la PNPase dans la formation de biofilm reste à expliquer complètement, alors qu'on ne sait toujours pas si la PNPase affecte la formation de biofilm chez les bactéries Gram-positives.

Dans ce travail, nous montrons que l'inactivation de la PNPase dans L. monocytogenes provoque une invasion cellulaire réduite et de forts défauts dans la production de biofilm, affectant grandement la composition de la matrice extracellulaire. En outre, l'analyse de séquençage de l'ARN a montré que la PNPase est impliquée dans la régulation de voies distinctes influençant la formation de biofilm, à savoir la détection du quorum et le métabolisme des glucides et des acides aminés. Par conséquent, nous présentons la PNPase comme un nouveau régulateur de biofilm chez les pathogènes à Gram positif.

La PNPase a été impliquée dans les processus liés à la virulence chez différentes espèces bactériennes, même si son rôle n'est pas encore complètement compris et peut différer d'une bactérie à l'autre (examiné dans la réf. 31). Pour déterminer si la PNPase est importante pour la virulence de L. monocytogenes, nous avons testé la capacité des souches de type sauvage (WT), du mutant de suppression de la PNPase (ΔpnpA) et des souches complétées par la PNPase (ΔpnpA :: pnpA) à envahir les cellules hôtes. Pour cela, nous avons utilisé deux lignées de cellules épithéliales humaines bien établies : HeLa (isolée du cancer du col de l'utérus et couramment utilisée comme modèle d'étude) et HepG2 (cellules dérivées d'hépatocytes, car le foie est une cible privilégiée pour l'infection à Listeria). Des cultures bactériennes ont été utilisées pour infecter les cellules humaines pendant une heure, suivies d'un traitement d'une heure avec de la gentamycine qui tue les bactéries extracellulaires40. Les bactéries intracellulaires ont été récupérées après la lyse de la cellule hôte et la viabilité a été déterminée sur des plaques de gélose BHI. Nos résultats ont montré que la PNPase était nécessaire pour l'entrée dans les deux lignées cellulaires, car le mutant ΔpnpA était moins invasif que le type sauvage (diminution d'environ 95 % dans HeLa et de 80 % dans HepG2) (Fig. 1). La souche complémentée a montré une récupération partielle dans l'infection par HeLa et une complémentation complète dans l'infection par HepG2. Ces résultats démontrent que la PNPase est importante pour l'infection à L. monocytogenes. Ce fait est conforme à ce qui a été décrit pour d'autres bactéries pathogènes34 et met en évidence un rôle de la PNPase dans la virulence bactérienne.

Quantification des bactéries intracellulaires dans les cellules HeLa et HepG2 à 2 heures post-infection, à MOI 50 pour HeLa et MOI 40 pour HepG2. Les valeurs moyennes des répliques ont été normalisées à la concentration d'inoculum (CFU/mL au moment de l'infection) et les données transformées ont été exprimées en pourcentage de bactéries survivantes par rapport au type sauvage. Les données représentent la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes. La signification a été déterminée par un test t non apparié ; *P < 0,05, **P < 0,01.

Des changements dans la taille, la forme et la motilité des cellules ont été associés à des défauts de virulence des agents pathogènes bactériens, car ces traits peuvent affecter l'invasion de l'hôte41,42. Pour déterminer si la différence de capacité de colonisation des cellules hôtes par les cultures Listeria monocytogenes EGD-e (type sauvage) et mutantes ΔpnpA pouvait résulter d'une variation phénotypique entre ces souches, nous avons d'abord analysé leur morphologie cellulaire microscopique (Fig. 2a). Aucune différence significative dans la taille des cellules n'a été trouvée entre ces deux souches ou la souche complémentée. Ensuite, nous avons analysé la morphologie des macrocolonies de toutes les souches cultivées sur des plaques de gélose BHI ; et des différences frappantes ont été observées (Fig. 2b). Toutes les colonies étaient caractérisées par un noyau central avec un anneau concentrique entouré d'une zone périphérique de morphologie lisse. Néanmoins, la région externe des macrocolonies de type sauvage et complémentées présentait un bord lobé, tandis que le mutant ΔpnpA présentait une zone de croissance lisse plus régulière. La différence la plus notable a été trouvée dans la région interne, car le type sauvage présentait un aspect granuleux. Au lieu de cela, le mutant ΔpnpA a montré une morphologie mouchetée, qui n'était pas confinée au noyau interne, mais elle a été observée dans toute la macrocolonie et ressemblait à des structures creuses à la surface (une image agrandie des zones représentatives de chaque macrocolonie est montrée pour mieux visualiser les différentes caractéristiques) (Fig. 2b). Ce phénotype n'a pas été observé dans la souche complémentée, qui ressemblait davantage à l'aspect granuleux trouvé sur le type sauvage. Étant donné que les flagelles et la motilité ont également été associées à la virulence, nous avons décidé d'évaluer si la PNPase pouvait affecter la capacité de nage de Listeria. Des cultures du type sauvage et du mutant ΔpnpA ont été déposées sur des plaques de gélose molle BHI (Fig. 2c). La suppression de la PNPase a entraîné une souche avec une motilité réduite (environ 70 % de moins) par rapport au type sauvage. Ce phénotype défectueux a été entièrement restauré dans la souche complémentée en PNPase.

a Images représentatives de cellules bactériennes individuelles en phase mi-exponentielle (OD600 à 0,7–0,8) pour évaluer la taille et la morphologie des cellules. Barres d'échelle, 1 µm (à gauche). Diagramme à barres de la taille moyenne des cellules de deux répliques biologiques indépendantes de chaque souche (à droite). Les données représentent la moyenne ± SD. La signification a été déterminée par un test t non apparié. ns, non significatif ; *P < 0,05. b Images représentatives de l'observation de la macrocolonie à l'aide d'un microscope à zoom. Chaque souche a été inoculée sur une plaque de gélose BHI et incubée à 37°C pendant 8 jours. Le panneau inférieur correspond à un grossissement de zoom. Barres d'échelle, 1000 µm. c Images représentatives de l'évaluation de la motilité de la nage à partir de cultures bactériennes repérées sur de l'agar BHI à 0,3 % (p/v) et incubées à 25 °C pendant 48 h (à gauche). Bar-plot des zones de baignade de chaque souche (à droite). Les valeurs de répétition moyennes ont été transformées en pourcentage de motilité par rapport au type sauvage. Les données représentent la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes. La signification a été déterminée par un test t non apparié ; **P < 0,01, ***P < 0,005.

Collectivement, ces résultats ont montré que l'inactivation de la PNPase provoque des changements phénotypiques, avec des différences trouvées dans la morphologie des colonies et la motilité cellulaire, qui sont corrélées à la nature moins invasive de cette souche.

La morphologie et la motilité des colonies sont deux phénotypes interconnectés connus pour affecter la formation de biofilms bactériens43,44. Pour déterminer si les défauts de morphotype et de motilité altérés trouvés dans le mutant PNPase de Listeria monocytogenes pourraient affecter la formation de biofilm, nous avons ensuite comparé la quantité de biofilm produit par les souches de type sauvage, ΔpnpA et complémentées. Les bactéries ont été cultivées en statique dans du milieu BHI à 37°C dans des plaques à 24 puits. Après l'élimination des cellules planctoniques et le lavage, les biofilms collés à la surface ont été colorés avec du cristal violet (CV). Nous avons observé que le mutant de suppression de Listeria PNPase était clairement défectueux (40% de moins) dans la formation de biofilm par rapport au type sauvage (Fig. 3a). Ce phénotype a été au moins partiellement récupéré dans la souche complémentée en PNPase. De plus, la morphologie du biofilm observée chez le mutant ΔpnpA était remarquablement différente des biofilms des deux autres souches (Fig. 3a, à gauche). L'inactivation de la PNPase a entraîné un biofilm avec des bords prononcés en forme de stries qui n'ont pas été détectés dans les cellules exprimant la PNPase. De plus, nous avons observé que le biofilm du mutant ΔpnpA se détachait plus facilement lors des étapes de lavage, suggérant que ce biofilm adhère moins et est moins structuré.

a Les biofilms ont été cultivés statiquement à 37 ° C pendant 48 h et la biomasse du biofilm a été déterminée à l'aide de la méthode de coloration au cristal violet. À gauche, les biofilms ont été imagés après l'ajout de cristal violet. Sur la droite, les valeurs moyennes de l'absorbance à 595 nm ont été tracées. Les données représentent la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes. La signification a été déterminée par un test t non apparié ; ***P < 0,005. b Les structures tridimensionnelles représentatives des biofilms ont été reconstruites après l'acquisition d'images z-stack par CLSM après croissance à 37 ° C pendant 48 h. c La biomasse, l'épaisseur maximale et le coefficient de rugosité des biofilms imagés ont été quantifiés par COMSTAT. Les valeurs répétées ont été moyennées et tracées. Les données représentent la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes. La signification a été déterminée par un test t non apparié ; *P < 0,05. d Images représentatives de biofilms observés par SEM à des grossissements de 2000x et ×10 000.

Pour évaluer davantage l'architecture du biofilm de Listeria, nous avons utilisé la microscopie confocale à balayage laser (CLSM). Les biofilms ont été cultivés sur des lamelles de verre sur des plaques à 24 puits pendant 48 h à 37 °C. Ensuite, les biofilms ont été délicatement lavés pour éliminer les cellules bactériennes non attachées et colorés avec SYTO™ 9, un colorant d'acide nucléique fluorescent à pénétration cellulaire qui marque les bactéries et l'ADN45 extracellulaire (eDNA). Des piles Z de chaque biofilm ont été obtenues et reconstruites en projections tridimensionnelles. Comme le montre la figure 3b, la souche de type sauvage Listeria a formé des biofilms qui ressemblaient à une pelouse dense de bactéries avec quelques agrégats cellulaires. En revanche, la souche mutante ΔpnpA a formé un biofilm clairsemé avec de nombreuses zones vides entre les cellules bactériennes individuelles. Dans la souche complétée par la PNPase, les biofilms ressemblaient à ceux formés par la souche de type sauvage. De plus, les différences structurelles dans la formation de biofilm ont été quantifiées (Fig. 3c). Le biofilm de type sauvage présentait plus de biomasse et était significativement plus épais que le biofilm mutant ΔpnpA. En ce qui concerne la rugosité du biofilm, les biofilms de type sauvage présentaient un coefficient de rugosité inférieur à celui du biofilm mutant ΔpnpA, car le type sauvage a un aspect plus homogène, tandis que le mutant ΔpnpA a un biovolume réduit et présente plus d'espaces creux. Les biofilms de la souche complétée par PNPase ont montré des valeurs intermédiaires de biomasse et de rugosité, bien que l'épaisseur maximale soit supérieure à celle du type sauvage en raison de l'hétérogénéité dans l'acquisition d'images z-stack. Ensemble, ces résultats valident les informations obtenues à partir des tests CV et indiquent ensemble une diminution de la formation de biofilm mutant ΔpnpA.

Pour mieux comprendre la nature morphologique de la formation réduite de biofilm de Listeria lorsque la PNPase n'est pas exprimée, l'architecture du biofilm du mutant de type sauvage, ΔpnpA et de la souche complétée par la PNPase a été étudiée plus en détail par microscopie électronique à balayage (SEM). Il a été facilement observé que les biofilms de la souche de type sauvage présentaient une surface lisse et hydratée qui était assez différente de la surface rugueuse et fissurée trouvée dans le mutant ΔpnpA (Fig. 3d). Un grossissement plus élevé a révélé que les bactéries de type sauvage étaient principalement couvertes par le matériel extracellulaire, ce qui rendait difficile l'observation des contours des cellules individuelles. À l'opposé, les bactéries mutantes ΔpnpA n'étaient pas intégrées dans une matrice extracellulaire dense et les cellules étaient facilement détectées. La souche complétée par PNPase a montré un phénotype de biofilm plus similaire au type sauvage avec une surface lisse et une teneur plus élevée en matrice extracellulaire que le mutant ΔpnpA. Cependant, nous notons que la complémentation n'était pas totale car certaines plaques de surface rugueuse du biofilm et des bactéries non piégées dans la matrice extracellulaire ont également été détectées. La complémentation partielle de différents phénotypes obtenus dans la souche ΔpnpA :: pnpA est probablement liée à différents niveaux d'expression de la PNPase dans les différentes conditions de test ici testées. Cela pourrait être une conséquence de la stratégie de clonage utilisée pour l'amplification du gène pnpA pour le clonage dans le plasmide pPL2, qui pourrait avoir manqué des régions activatrices ou d'autres promoteurs situés dans la séquence en amont de pnpA (voir "Méthodes").

Dans l'ensemble, cet ensemble de résultats a montré que la PNPase affecte les biofilms de L. monocytogenes en perturbant la formation de la matrice extracellulaire. L'inactivation de Listeria PNPase conduit à des biofilms réduits et plus minces avec une teneur significativement plus faible de sa matrice extracellulaire.

La matrice des biofilms de Listeria monocytogenes est composée d'EPS, à savoir l'eDNA, de protéines et de polysaccharides46. Suite à l'ensemble de résultats précédent, nous avons étudié la composition de la matrice du biofilm macromoléculaire du type sauvage, ΔpnpA, et des souches complétées pour comprendre si les différences observées dans la structure et la morphologie du biofilm étaient dues à des changements dans la composition de la matrice. Les biofilms cultivés pendant 48 h à 37 ° C ont été retirés de la surface abiotique et soumis à une sonication pour séparer l'EPS des cellules bactériennes. Après sonication, la DO600 a été mesurée pour une normalisation supplémentaire de chaque composant de la matrice par rapport à la biomasse totale du biofilm de chaque souche. L'EPS récupéré dans le surnageant a ensuite été quantifié à l'aide de techniques biochimiques distinctes selon le composant de l'étude : méthode d'extraction au phénol-chloroforme pour l'eDNA, méthode de Bradford pour les protéines et méthode à l'acide phénol-sulfurique pour les polysaccharides. Remarquablement, les résultats indiquent que la quantité des trois principaux composants de la matrice extracellulaire de Listeria a été réduite dans la souche mutante ΔpnpA par rapport au type sauvage (Fig. 4a). De plus, nous avons observé que la souche complémentée était capable de récupérer partiellement le phénotype de type sauvage.

a Quantification relative de la teneur en ADN extracellulaire, en protéines et en polysaccharides dans la matrice de biofilms cultivés pendant 48 h à 37 °C. Les valeurs de répétition moyennes ont été transformées en pourcentage par rapport au type sauvage. Les données représentent la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes. La signification a été déterminée par un test t non apparié ; *P < 0,05, **P < 0,01. b Images représentatives de l'analyse CLSM de la composition de la matrice du biofilm. Le SYTO™ 9 a été utilisé comme témoin pour teindre les bactéries, l'iodure TO-PRO™-3 a été utilisé pour la coloration de l'ADN extracellulaire, le SYPRO® Ruby pour la coloration des protéines et le RR-OP pour la coloration des polysaccharides.

Pour valider davantage ces résultats et visualiser les différents composants de la matrice, des biofilms cultivés en 48h ont ensuite été analysés par CLSM après coloration avec des colorants spécifiques pour chaque composant, comme le montrent les images représentatives de la Fig. 4b. Le colorant fluorescent à l'iodure TO-PRO™-3 cible les acides nucléiques, mais pas les bactéries dont les membranes sont intactes. Ainsi, il a été utilisé pour la détection d'ADNe sur la matrice extracellulaire car il permet la distinction entre l'ADNe et l'ADN trouvé à l'intérieur des cellules du biofilm, lorsqu'il est utilisé simultanément avec le colorant SYTO™ 945. Sur la figure 4b, une forte réduction des niveaux d'ADNe a été détectée dans le biofilm mutant ΔpnpA avec seulement quelques cellules colorées, tandis qu'un motif stellaire d'ADNe a été observé dans le biofilm de type sauvage. Le colorant FilmTracer ™ SYPRO® Ruby Biofilm Matrix est utilisé pour la détection des protéines47 et a pu se lier à des agrégats riches en protéines dans la matrice du biofilm de type sauvage, mais n'a coloré que des cellules individuelles dans le biofilm mutant ΔpnpA (Fig. 4b). Cela démontre qu'il y a une teneur en protéines inférieure dans la matrice extracellulaire de la souche déficiente en PNPase. La coloration des polysaccharides présents dans la matrice du biofilm de Listeria était une procédure plus difficile. Tout d'abord, nous avons testé le colorant fluorescent agglutinine de germe de blé (WGA) conjugué à Alexa Fluor 633, couramment utilisé pour détecter les polysaccharides dans les biofilms à Gram positif, notamment dans Staphylococcus aureus48. Cependant, ce colorant n'était pas efficace dans le marquage des polysaccharides dans les biofilms de Listeria, du moins dans les conditions ici testées. Pour surmonter cette difficulté, nous avons ensuite testé le rouge de ruthénium (RR), un colorant qui se lie aux glucides et qui était connu pour colorer les biofilms de Listeria49. RR n'est pas fluorescent, mais lorsqu'il est conjugué avec de la 1,10-phénanthroline (OP) non fluorescente, il en résulte le complexe RR-OP fluorescent, précédemment utilisé pour marquer des substrats anioniques comme la chromatine des noyaux des érythrocytes50. Nous avons synthétisé RR-OP et testé sa capacité à marquer les polysaccharides présents dans Listeria EPS. Comme observé sur la figure 4b, RR-OP se lie avec succès aux polysaccharides présents dans la matrice du biofilm. La coloration était plus intense dans la matrice de type sauvage mais tachait mal le mutant ΔpnpA, montrant qu'il y avait des niveaux inférieurs de polysaccharides dans la matrice du biofilm mutant. À notre connaissance, c'était la première fois que RR-OP était utilisé comme méthode de coloration fluorescente pour les polysaccharides sur les biofilms de Listeria, fournissant un nouvel outil qui pourrait être utile pour l'étude des biofilms bactériens. Pris ensemble, ces résultats montrent que l'inactivation de la PNPase conduit à la réduction de l'EPS dans les biofilms de Listeria, affectant les niveaux d'ADNe, de protéines et de polysaccharides.

Les biofilms sont plus résistants à l'action des agents antimicrobiens en raison de leur structure robuste et du rôle protecteur de la matrice environnante. Étant donné que l'inactivation de la PNPase conduit à des biofilms plus minces avec moins de contenu en EPS, nous avons ensuite évalué si les biofilms déficients en PNPase étaient moins résistants au traitement antibiotique. Les deux antibiotiques utilisés pour le traitement de la listériose ont été sélectionnés, en l'occurrence la gentamicine et l'érythromycine (considérées respectivement comme agents thérapeutiques de première et de deuxième intention51,52). Premièrement, les concentrations minimales inhibitrices (CMI) des cultures planctoniques cultivées en bouillon BHI ont été déterminées et n'ont révélé aucune différence entre les souches, en termes de cultivabilité bactérienne dans les plaques BHI-A (3 µg/mL pour la gentamicine et 0,1 µg/mL pour l'érythromycine). Ensuite, des biofilms de type sauvage et mutant ΔpnpA cultivés en statique dans du BHI pendant 48 h ont été soumis à un traitement avec de fortes doses de chaque antibiotique. Après 24 h, les biofilms ont été lavés, soumis à un bain à ultrasons et grattés pour libérer les cellules attachées de la surface abiotique. Les cellules de biofilm récupérées ont été étalées dans des plaques de gélose BHI pour l'évaluation des UFC/mL. En parallèle, le BHI sans antibiotique a été utilisé comme témoin de cultivabilité cellulaire. Il n'y avait aucune différence significative entre le mutant de type sauvage et le mutant ΔpnpA lorsqu'aucun antibiotique n'était ajouté aux biofilms préformés, ce qui montre que l'inactivation de la PNPase n'affecte pas la cultivabilité cellulaire dans les biofilms de Listeria (Fig. 5). En revanche, chaque traitement antibiotique a entraîné une cultivabilité inférieure pour le mutant ΔpnpA par rapport au type sauvage, bien que nous ayons noté que cette réduction était inférieure à 1 log. Cet effet était plus prononcé avec le traitement à la gentamicine (la souche ΔpnpA était 75% moins cultivable), bien qu'une réduction de la cultivabilité ait également été observée lorsque l'érythromycine était utilisée (la souche ΔpnpA était 40% moins cultivable) (Fig. 5). La souche complémentée a montré une complémentation presque complète dans les deux traitements antibiotiques. Ces résultats montrent que le biofilm du mutant PNPase est plus sensible aux antibiotiques que le type sauvage. Ceci est entièrement d'accord avec nos observations précédentes selon lesquelles les biofilms déficients en PNPase sont moins structurés et ont moins de composants de matrice extracellulaire.

Des biofilms cultivés pendant 48 h à 37 °C ont été soumis à un traitement de 24 h avec de fortes doses de gentamicine (10X MIC) ou d'érythromycine (100X MIC). Comme contrôle de la cultivabilité bactérienne, le BHI a été ajouté à la place de l'antibiotique. Après chaque traitement, les cellules cultivables récupérées ont été quantifiées en UFC/mL. Les valeurs répétées ont été moyennées et transformées en pourcentage de CFU/mL par rapport au type sauvage. Les données représentent la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes. La signification a été déterminée par ANOVA à deux facteurs ; ns, non significatif ; ****P < 0,0001.

Pour mieux comprendre comment la PNPase affecte l'expression des gènes dans la formation du biofilm, nous avons comparé le transcriptome entre le mutant ΔpnpA et les cultures de biofilm de type sauvage. L'ARN total a été extrait de cultures de biofilm cultivées pendant 48 h à 37 ° C et soumis à un séquençage d'ARN (RNA-seq). À partir des données d'ARN-seq, nous avons évalué l'expression différentielle du transcrit entre le mutant ΔpnpA et les biofilms de type sauvage en calculant et en traçant le changement de pli pour chaque transcrit dans un diagramme de dispersion MA (Fig. 6a). Pour déterminer les gènes différentiellement exprimés (DEG) qui étaient statistiquement significatifs, nous avons défini les paramètres suivants : un taux de fausse découverte (FDR) inférieur à 0,1, un facteur de changement supérieur à 2 et une valeur d'expression des transcrits (log2 CPM) supérieure à 3. Bien que la dispersion des valeurs de changement de facteur log2 ait été considérablement réduite pour la plupart des transcrits, un total de 103 gènes ont été exprimés de manière différentielle (tableau supplémentaire 1), dont 46 ont été régulés à la baisse. , et 57 ont été régulés positivement (Fig. 6a). Remarquablement, lorsque les DEG ont été regroupés en fonction de leur rôle biologique général, nous avons observé que la majorité des DEG faisait partie des groupes « Transport et métabolisme des glucides » (n = 14) ou « Transport et métabolisme des acides aminés » (n = 11), avec les DEG non catégorisés (n = 37) (Fig. 6b). Ensuite, les DEG ont été cartographiés dans la base de données KEGG pour attribuer chaque gène à sa voie respective, suivis d'une analyse d'enrichissement de la voie KEGG (Fig. 6c). Les résultats ont montré un enrichissement des voies impliquées dans les "Voies métaboliques" (n = 36), la "Biosynthèse des métabolites secondaires" (n = 22) et le "Métabolisme microbien dans divers environnements" (n = 14). Nous pouvons observer une bonne corrélation entre les catégories déterminées à la Fig. 6b et les voies KEGG enrichies décrites à la Fig. 6c : la catégorie « Transport et métabolisme des acides aminés » est soutenue par l'enrichissement des voies « Biosynthèse des acides aminés », « Métabolisme de l'alanine, de l'aspartate et du glutamate » et « Biosynthèse de la valine, de la leucine et de l'isoleucine » ; de la même manière, la catégorie « Transport et métabolisme des glucides » peut englober les voies KEGG « Métabolisme du carbone », « Cycle du citrate », et « Glycolyse/Gluconéogenèse ».

un nuage de points MA comparant l'expression des transcrits entre deux réplicats biologiques de L. monocytogenes EGD-e de type sauvage et de biofilms mutants ΔpnpA. Les gènes avec des expressions significativement différentes sont surlignés en rouge s'ils sont régulés positivement ou en vert s'ils sont régulés négativement dans les biofilms ΔpnpA par rapport au type sauvage. Le seuil FDR est <0,10. Les deux lignes horizontales correspondent au seuil d'un changement de facteur log2 de 1, et la ligne verticale au seuil du log2 CPM de 3. NS non significatif. b Visualisation globale des gènes différentiellement exprimés (DEG) divisés en catégories biologiques générales. Le nombre de gènes appartenant à chaque catégorie est en blanc. c DEG avec un enrichissement significativement accru regroupés en voies KEGG prédites. d Carte thermique du profil transcriptionnel des DEG. Un regroupement hiérarchique a été effectué pour regrouper les gènes ayant un modèle d'expression similaire en termes de log2 RPKM. e Lisez les tracés de couverture de trois gènes régulés positivement (lmo0096, lmo0783, lmo0784) et de trois gènes régulés négativement (lmo1984, lmo1986, lmo2006). lmo0783-0784 sont représentés en opéron. La ligne bleue correspond au type sauvage, tandis que la ligne rouge correspond au mutant ΔpnpA. L'axe y représente la couverture des lectures et la valeur maximale de chaque gène est indiquée. L'axe des x représente la position du gène.

Une carte thermique a été tracée, montrant les valeurs d'expression normalisées des DEG dans les souches mutantes de type sauvage et ΔpnpA (Fig. 6d). Nous avons ensuite sélectionné six de ces transcrits exprimés de manière différentielle (3 gènes régulés à la hausse et 3 à la baisse) comme exemples de nos données d'ARN-seq et tracé leur couverture de lecture pour évaluer la profondeur de séquençage dans les deux souches (Fig. 6e). Ensuite, les gènes qui présentaient des log2 FC supérieurs et inférieurs et qui avaient été précédemment associés à la formation de biofilms selon la littérature ont été sélectionnés comme gènes représentatifs (tableau 1). Par exemple, l'inactivation de la PNPase a conduit à la régulation à la hausse des gènes du système de détection de quorum Agr (lmo0048, lmo0049), des gènes des systèmes de transport du mannose/glucose (lmo0096, lmo0783, lmo0784) et du maltose (lmo2124, lmo2125), ainsi que des gènes impliqués dans la voie des pentoses phosphates (lmo0342, lmo0 343, lmo0345). Les catégories fortement régulées à la baisse par l'inactivation de la PNPase étaient le "transport et métabolisme des acides aminés" (lmo1733, lmo1835, lmo1984, lm01986, lmo2006) ainsi que la "production et conversion d'énergie" (lmo1052-1055). Les résultats d'ARN-seq ont été validés par analyse qPCR, en utilisant un sous-ensemble de ces gènes représentatifs (tableau 1). Nous avons observé une bonne corrélation entre les deux techniques, indiquant que les résultats de qPCR étaient cohérents avec les données RNA-seq.

Nos résultats ont montré qu'il y avait une expression altérée dans les catégories biologiques importantes pour la formation de biofilm dans le biofilm mutant ΔpnpA par rapport au type sauvage, et la majorité des DEG sous le contrôle de la PNPase sont intégrés dans les processus liés aux glucides ou aux acides aminés. Ces données corroborent notre précédente série de résultats montrant que la PNPase affecte les niveaux de polysaccharides et de protéines de la matrice extracellulaire des biofilms de Listeria monocytogenes.

Pour évaluer davantage le rôle de la PNPase dans la régulation des DEG les plus significatifs, nous avons effectué des tests de stabilité de l'ARNm de la rifampicine comparant le mutant ΔpnpA avec des cultures de type sauvage. En raison de difficultés techniques dans la réalisation de cette technique dans les biofilms, nous avons alternativement utilisé des cultures en phase stationnaire cultivées dans du milieu BHI à 37 ° C car à ce stade de croissance, les bactéries sont plus physiologiquement similaires aux bactéries sessiles présentes dans les biofilms53. Les niveaux des ARNm des gènes d'intérêt ont été évalués par Northern blot à l'aide de sondes spécifiques.

Nous avons observé que l'inactivation de la PNPase entraînait une forte stabilisation des ARNm à partir de DEG régulés positivement (tableau 1), à savoir : le système de détection de quorum lmo0048/agrB, la sous-unité de transporteur PTS lmo0096/manL et le sucre ABC-transporteur lmo2125/malE (Fig. 7a). Cette stabilisation a été particulièrement évidente lors de l'analyse des ARNm lmo0048 et lmo0096, qui ont montré des niveaux à peine détectés dans le type sauvage, ne permettant pas une quantification fiable des demi-vies des ARNm dans cette souche. Nous avons noté que deux bandes de tailles différentes ont été observées avec la sonde lmo0048 : une bande plus longue correspondant à l'ARNm monocistronique (détecté à la fois dans le WT et le mutant ΔpnpA) et une bande plus courte correspondant à un intermédiaire de désintégration (uniquement détecté dans le mutant ΔpnpA). Les niveaux des deux espèces d'ARNm sont plus élevés chez le mutant ΔpnpA par rapport à la souche de type sauvage, étant particulièrement évidente la forte accumulation du transcrit plus court en l'absence de PNPase. Il est possible que l'ARNm plus court conduise à la production d'une protéine tronquée Lmo0048/AgrB, qui peut encore être partiellement fonctionnelle et affecter potentiellement les voies liées au biofilm. Dans l'ensemble, cet ensemble de résultats démontre que la PNPase agit comme un régulateur post-transcriptionnel en agissant comme une enzyme principale impliquée dans la dégradation des ARNm des gènes régulés positivement identifiés dans notre analyse ARN-seq. Au contraire, il a été observé que l'ARNm d'un gène régulé négativement sélectionné (lmo2006) se décomposait légèrement plus rapidement chez le mutant ΔpnpA, ce qui contribue probablement aux niveaux réduits observés de ce transcrit dans cette souche.

a Northern blots sondé avec des oligos spécifiques pour la détection de lmo0048, lmo0096, lmo2125 et lmo2006, comparant l'ARN extrait de cultures traitées à la rifampicine de souche mutante de type sauvage et ΔpnpA. La stabilité de l'ARN est indiquée en minutes sous le transcrit respectif. L'ARNtm sert de contrôle de chargement. Un gel représentatif est montré pour chaque sonde de deux répliques indépendantes. Un marqueur de taille d'ARN est affiché sur la gauche du panneau. Deux bandes ont été détectées avec la sonde lmo0048 ; la quantification de la demi-vie illustrée ci-dessous, l'image correspondante est liée à la bande la plus courte. La quantification de la bande supérieure a montré une stabilité de 6,2 ± 0,6 chez le type sauvage et de 7,0 ± 0,58 chez le mutant ΔpnpA. NQ non quantifiable. b Activité β-galactosidase de la fusion Plmo0048-lacZ et de la fusion Plmo2006-lacZ dans une souche mutante de type sauvage et ΔpnpA cultivée dans BHI jusqu'à la phase stationnaire. Les données représentent la moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes. La signification a été déterminée par ANOVA à deux facteurs ; ns, non significatif ; *P < 0,05. c Northern blots sondés avec des oligos spécifiques pour la détection de prfA, hly, inlA et mogR, comparant l'ARN extrait de cultures traitées à la rifampicine de souche mutante de type sauvage et ΔpnpA. La stabilité de l'ARN est indiquée en minutes sous l'image correspondante. L'ARNtm sert de contrôle de chargement. Un gel représentatif est montré pour chaque sonde de deux répliques indépendantes. Un marqueur de taille d'ARN est affiché sur la gauche du panneau. d Analyse Western blot de l'extrait protéique total à l'aide d'un anticorps anti-InlA. L'anticorps anti-EF-Tu a été utilisé comme témoin de chargement. Quantification relative du QR.

De plus, nous avons construit et analysé des fusions transcriptionnelles pour tester si la PNPase pouvait affecter la transcription de lmo0048/agrB (un gène régulé positivement) et/ou de lmo2006/alsS (un gène régulé négativement) (Fig. 7b). L'activité de promoteur de ces gènes a été analysée en utilisant le plasmide pTCV et lacZ comme gène rapporteur54. Les dosages de la β-galactosidase ont montré qu'il n'y avait pas de différences significatives entre le type sauvage et le mutant ΔpnpA, ce qui suggère que la PNPase n'affecte pas de manière significative la transcription de ces gènes. Considérant que nous n'observons pas de changements significatifs dans la transcription de lmo0048 (Fig. 7b), cela confirme que les niveaux plus élevés des deux ARN de la Fig. 7a sont dus à leur stabilisation en l'absence de PNPase ; par conséquent, la PNPase est responsable de leur dégradation. La transcription plus courte de lmo0048 n'était pas une conséquence d'une transcription accrue ; au lieu de cela, cet ARNm résulte très probablement du clivage du transcrit plus long de lmo0048 par d'autres ribonucléases, rapidement éliminé par la PNPase, ce qui explique pourquoi cet ARNm n'a pas été détecté chez le type sauvage (Fig. 7a).

Puisque nous avons observé que l'inactivation de la PNPase entraîne une réduction de l'invasion des lignées cellulaires humaines (Fig. 1) et de la motilité bactérienne (Fig. 2), nous avons encore étendu nos études aux gènes importants pour ces phénotypes, même s'ils ne semblent pas être exprimés de manière différentielle dans nos données transcriptomiques de biofilm. En utilisant des tests de stabilité de l'ARNm de la rifampicine et une analyse par transfert de Northern, il a été constaté que l'inactivation de la PNPase entraînait une baisse des niveaux d'ARNm de l'activateur transcriptionnel des gènes de virulence, prfA, ainsi que de deux gènes régulés par prfA, à savoir, inlA (codifie pour l'internaline A) et hly (codifie pour la listeriolysine O) dans des cultures en phase stationnaire (Fig. 7c). Cette régulation semble être causée indirectement, car la stabilité de ces transcrits n'a pas été fortement affectée par l'absence de PNPase. Nous avons également observé des niveaux réduits de protéines d'internaline A dans des extraits cellulaires du mutant ΔpnpA, montrant que les niveaux réduits d'ARNm inlA sont corrélés à des niveaux inférieurs de protéines (Fig. 7d). D'autre part, nous avons observé que la PNPase n'affecte pas les niveaux et la stabilité de l'ARNm de mogR, le répresseur transcriptionnel des gènes de motilité (Fig. 7c).

Dans l'ensemble, ces résultats montrent que la PNPase régule les niveaux d'expression des gènes impliqués dans le biofilm et la virulence et soutient que la PNPase est une enzyme importante impliquée dans la régulation post-transcriptionnelle de la formation du biofilm.

Dans ce travail, nous présentons la ribonucléase PNPase comme un nouveau régulateur de la formation de biofilm et de la virulence chez le pathogène Gram positif Listeria monocytogenes. Nous démontrons que la PNPase est un déterminant positif de la production de biofilm dans la souche EGD-e de L. monocytogenes, affectant la biomasse, la morphologie et la structure du biofilm. La souche à suppression de PNPase a produit moins de biomasse de biofilm, présentant un biofilm plus fin, plus rugueux et d'apparence sèche, et moins structuré que le type sauvage. Ceci était corrélé avec des défauts majeurs dans la composition de la matrice extracellulaire du biofilm du mutant ΔpnpA, qui présentait une teneur mineure en protéines, polysaccharides et ADN extracellulaire, détectée par des tests biochimiques et la microscopie. En effet, les bactéries présentes dans les biofilms ΔpnpA ne se retrouvent pas noyées de manière significative dans une couche de matrice, contrairement à ce qui est observé dans les biofilms de type sauvage où les bactéries sont entourées d'une matrice épaisse. Ces défauts structurels rendent une faible production de biofilm chez le mutant ΔpnpA, ce qui provoque très probablement la sensibilité accrue des biofilms de Listeria aux antibiotiques. De plus, l'inactivation de Listeria PNPase a entraîné des changements phénotypiques dans les macrocolonies et une réduction de la motilité cellulaire, deux caractéristiques largement associées à la formation de biofilm.

La PNPase a déjà été associée à la formation de biofilms chez les bactéries Gram-négatives ; cependant, son rôle exact est controversé. Alors que la PNPase s'est avérée être un régulateur positif de la formation de biofilm dans E. coli K-1238 et dans Salmonella Typhimurium36,37, une autre étude utilisant E. coli C a proposé la PNPase comme inhibiteur de la formation de biofilm39. L'effet de la PNPase dans la production de biofilm semble donc être dépendant de l'espèce, du moins chez les bactéries Gram-négatives. Néanmoins, il existe actuellement un manque d'informations sur le rôle de la PNPase dans l'établissement de biofilms chez les bactéries Gram-positives et nos travaux visent à combler cette lacune. Pour mieux comprendre comment la PNPase contribue à la formation de biofilms de L. monocytogenes, l'analyse transcriptomique des biofilms mutants de type sauvage et ΔpnpA a été réalisée. La PNPase s'est avérée affecter les niveaux d'expression de plusieurs gènes et de plusieurs voies de régulation, comme on s'y attendait d'un régulateur post-transcriptionnel majeur. Un total de 103 DEG affectés par la PNPase, avec 57 et 46 gènes montrant une régulation à la hausse et à la baisse, respectivement, ont été obtenus par RNA-seq. La majorité des DEG faisaient partie soit du groupe « Transport et métabolisme des glucides », soit du groupe « Transport et métabolisme des acides aminés ».

Les gènes impliqués dans la détection du quorum et les gènes impliqués dans le transport et le métabolisme des glucides sont parmi les gènes les plus régulés à la hausse dans les biofilms de Listeria n'exprimant pas la PNPase (Fig. 6 et Tableau 1). Initialement décrit chez S. aureus, le système de type détection de quorum Agr chez L. monocytogenes est codé dans l'opéron lmo0048-lmo005155. Nos résultats ont révélé la régulation à la hausse des gènes lmo0048 (codant pour un homologue de l'histidine kinase capteur de S. aureus AgrB) et lmo0049 (codant pour un homologue du peptide autoinducteur de S. aureus AgrD) dans les biofilms du mutant ΔpnpA (Fig. 6 et Tableau 1). Il a été précédemment montré que l'opéron Agr est important pour la formation du biofilm de Listeria puisque les mutants Agr, à savoir Δlmo0049 (ΔagrD), ont été affectés dans l'adhérence et dans les 24 premières heures de formation du biofilm20,21,56. L'expression de l'opéron agr de L. monocytogenes est soumise à une régulation temporelle, avec des niveaux d'expression croissants trouvés dans les premiers stades de la croissance du biofilm, puis déclinant à mesure que le biofilm mûrit13. Nous observons que cette régulation temporelle du système agr est défectueuse en l'absence de PNPase ; les niveaux élevés de transcrits agrB et agrD observés dans les biofilms après 48 h de croissance pourraient aider à expliquer la réduction de la biomasse du biofilm trouvée chez le mutant ΔpnpA.

De plus, plusieurs gènes impliqués dans le transport du sucre et la bioénergétique se sont avérés régulés positivement dans les biofilms mutants ΔpnpA. Ceux-ci comprennent des gènes du système sucre: phosphotransférase (PTS) dépendant du phosphoénolpyruvate (PEP) pour l'absorption à haute affinité du mannose et du glucose. Le PTS comprend deux protéines phosphotransférases générales (EI et HPr) et un nombre variable de complexes d'enzymes II spécifiques du sucre ; EI et HPr transfèrent des groupes phosphoryle de PEP à EIIAB qui est responsable de la phosphorylation de différents sucres, avec EIICD agissant comme transporteurs57,58. Nos résultats indiquent la régulation positive de lmo0096 (EIIABMan/Glu) de l'opéron Man et lmo0783 (EIIAMan/Glu) et lmo0784 (EIIBMan/Glu) de l'opéron Mpo. La régulation à la hausse de ces PTS peut représenter une augmentation de la consommation de PEP glycolytique, réduisant ainsi sa disponibilité pour la biosynthèse des acides aminés aromatiques et des précurseurs de la paroi cellulaire59. Cela contribue très probablement à la production plus faible de matrice de biofilm observée dans les biofilms de Listeria ΔpnpA. En accord avec cette hypothèse, les enzymes PTS sont régulées à la baisse lors de la formation de biofilm dans d'autres bactéries Gram-positives, comme observé dans Streptococcus pneumoniae60 et dans les biofilms forts et faibles d'Enterococcus faecalis61. D'autres gènes régulés à la hausse comprennent lmo2124 et lmo2125 qui codent pour le transporteur de cassette de liaison à l'ATP responsable de l'absorption de maltose/maltodextrine, qui est ensuite utilisé dans la glycolyse sous forme de glucose62. We also observed the upregulation of seven genes from the gol operon (lmo0341-0351), which encode for enzymes involved in the non-oxidative phase of the pentose phosphate pathway (lmo0342, lmo0343, and lmo0345), in glycerol metabolism (lmo0344, lmo0347, and lmo0348) and in glycolysis (lmo0346)63,64. Au total, l'expression plus élevée de ces gènes suggère que le métabolisme des glucides se concentre préférentiellement sur la production d'énergie plutôt que sur les voies de biosynthèse. Cela pourrait en outre aider à expliquer la faible biosynthèse des composants de la matrice et la formation de biofilm défectueuse qui en résulte observée en l'absence de PNPase.

Parmi les gènes régulés à la baisse trouvés dans les biofilms défectueux en PNPase, il a également été possible d'identifier les voies métaboliques affectant la formation de biofilm (Fig. 6 et Tableau 1). Une catégorie majeure était le métabolisme des acides aminés et comprenait les gènes lmo1984 (ilvB), lmo1986 (ilvC), lmo2006 (alsS), qui sont impliqués dans la synthèse des acides aminés à chaîne ramifiée tels que l'isoleucine, la leucine et la valine. Il a été démontré que ces acides aminés favorisent la formation de biofilms robustes dans différentes bactéries : par exemple, des niveaux élevés de leucine et de valine ont été trouvés dans les biofilms d'E. coli65,66 ; ils font partie des acides aminés promoteurs de biofilms identifiés chez Pseudomonas aeruginosa67 ; et, le métabolisme de l'isoleucine, de la leucine et de la valine est essentiel lors de la formation du biofilm de Bifidobacterium bifidum68. Un autre gène régulé à la baisse impliqué dans le métabolisme des acides aminés est lmo1733 (gltD), qui code la plus petite sous-unité de la glutamate synthase et est responsable de la conversion de la glutamine en glutamate. Cet acide aminé s'est également avéré affecter la formation de biofilm, avec des défauts dans cette voie métabolique entraînant une adhérence réduite aux surfaces solides et, par conséquent, moins de formation de biofilm chez L. monocytogenes69 et Bacillus subtilis70. Dans l'ensemble, l'expression réduite de ces gènes d'acides aminés est en accord avec la plus faible teneur en protéines de la matrice extracellulaire et le biofilm moins structuré observé chez le mutant ΔpnpA. En outre, un autre ensemble de gènes régulé négativement consiste en l'opéron lmo1052-1055 codant pour le complexe pyruvate déshydrogénase (opéron pdh), responsable de la conversion du pyruvate en acétyl-CoA. Chez Streptococcus suis, l'expression protéique de PDH était plus élevée dans l'état de biofilm que dans le planctonique71 et la formation de biofilm était significativement diminuée après la suppression de PDH72.

Les tests de stabilité de l'ARNm de la rifampicine et l'analyse par Northern blot ont révélé que la PNPase est impliquée dans la dégradation d'au moins un sous-ensemble représentatif des gènes régulés positivement identifiés dans l'analyse transcriptomique des biofilms. Dans la souche mutante ΔpnpA, une forte stabilisation des transcrits de lmo0048/agrB, lmo0096/manL et lmo2125/malE a été observée par rapport à la souche de type sauvage. Les niveaux élevés de ces transcrits ne semblent pas être la conséquence d'une transcription accrue en l'absence de PNPase, car une fusion transcriptionnelle du promoteur de lmo0048 avec lacZ n'a montré aucune différence significative dans l'activité de la β-galactosidase entre le type sauvage et la souche mutante ΔpnpA. Ces résultats confirment que la PNPase est un important régulateur post-transcriptionnel des gènes impliqués dans la formation du biofilm, soutenant que les DEG régulés à la hausse sont une conséquence de la stabilité accrue de ces transcrits en l'absence de PNPase. Les niveaux plus élevés de ces ARNm peuvent potentialiser la traduction des protéines correspondantes, affectant ainsi les voies de formation du biofilm.

D'autre part, il a été observé que l'ARNm de lmo2006/alsS se décomposait légèrement plus rapidement chez le mutant ΔpnpA. Cela suggère que la PNPase peut agir indirectement pour contrôler la stabilité des ARNm des DEG régulés à la baisse. Par exemple, la PNPase pourrait contrôler les niveaux d'un répresseur de ces transcrits (comme les ARNs)73,74, ou la PNPase pourrait protéger ces ARNm de la dégradation par d'autres ribonucléases, de la même manière que ce qui a été décrit pour la RNase II chez E. coli75.

De plus, la PNPase s'est avérée affecter l'expression de gènes importants pour la virulence de Listeria. De manière frappante, le mutant ΔpnpA a montré des niveaux réduits d'ARNm de l'activateur transcriptionnel des gènes de virulence, prfA, ce qui pourrait impliquer des niveaux inférieurs de protéine PrfA. Étant donné que la PrfA est autorégulée, il semble probable que des niveaux inférieurs de PrfA pourraient entraîner une réduction de l'expression des facteurs de virulence76. En effet, nous avons observé que les facteurs de virulence inlA/Internaline A et hly/Listeriolysine O présentaient des valeurs réduites d'ARNm chez le mutant ΔpnpA sans différences majeures dans les demi-vies d'ARNm entre le mutant ΔpnpA et la souche sauvage. Fait important, nous avons constaté une diminution des niveaux d'internaline A en l'absence de PNPase (Fig. 7). La moindre expression de ces facteurs de virulence pourrait en effet contribuer à expliquer la moindre invasion des lignées cellulaires humaines par le mutant ΔpnpA. De plus, la diminution de l'expression de PrfA contribue probablement aux niveaux réduits de biofilms observés chez les mutants ΔpnpA. Des rapports antérieurs ont souligné que PrfA et les membres du régulon PrfA agissent comme des déterminants positifs de la production de biofilm chez Listeria monocytogenes, étant donné que les mutants étaient défectueux dans la formation de biofilm collé à la surface23,77,78. Il a été proposé23 que ces défauts pourraient résulter d'altérations de la surface cellulaire préjudiciables au développement du biofilm, car PrfA régule l'expression de facteurs de surface cellulaire (comme l'internaline A) et de protéines sécrétées (comme la listeriolysine O), dont les niveaux d'ARNm étaient également réduits chez le mutant ΔpnpA. Enfin, nous avons également testé si la PNPase était impliquée dans la régulation de MogR, le répresseur transcriptionnel des gènes de motilité flagellaire. Cependant, il n'a pas été constaté que la PNPase affecte les niveaux d'ARNm de mogR, ce qui signifie que le défaut de motilité observé dans la souche mutante ΔpnpA semble être indépendant de MogR. Par conséquent, la régulation dépendante de la PNPase de la motilité bactérienne est plus complexe que prévu.

L. monocytogenes est un agent pathogène majeur d'origine alimentaire et l'agent causal de la listériose, une infection bactérienne à taux de mortalité élevé chez les patients immunodéprimés9. La contamination des produits alimentaires due à la présence de biofilms dans les environnements de transformation des aliments représente un fardeau économique dans le monde entier79. Nous avons identifié la protéine de liaison à l'ARN et la ribonucléase PNPase comme un régulateur important de la pathogénicité de L. monocytogenes, affectant non seulement l'invasion des cellules de l'hôte, mais également la formation de son biofilm. De plus, nous avons découvert des voies de régulation dépendantes de la PNPase importantes pour le développement des biofilms de Listeria, soulignant l'importance de la régulation post-transcriptionnelle pour l'adaptation au mode de vie du biofilm des bactéries pathogènes. D'autres protéines de liaison à l'ARN, telles que Hfq et CsrA, se sont avérées impliquées dans le contrôle de la formation de biofilm, notamment par leur effet sur la motilité, la production de polysaccharides extracellulaires, la production de c-di-GMP, entre autres29,80,81,82.

En conclusion, nous avons démontré pour la première fois que la PNPase est un régulateur post-transcriptionnel de la formation du biofilm de Listeria monocytogenes, l'inactivation de la PNPase entraînant une réduction de la production de biofilm. Nos résultats montrent que la PNPase affecte plusieurs voies métaboliques, du métabolisme des glucides au métabolisme des acides aminés et au système de détection du quorum, affectant la production de matrice extracellulaire et par conséquent la formation de biofilms de Listeria sur les surfaces abiotiques. Ce travail met en évidence l'importance des protéines de liaison à l'ARN dans l'adaptation à un mode de vie sessile et élargit nos connaissances sur la formation de biofilms chez les bactéries pathogènes à Gram positif.

Toutes les souches bactériennes et tous les plasmides sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 2. Les souches utilisées dans cette étude sont la souche Listeria monocytogenes EGD-e (type sauvage) et son mutant isogénique ΔpnpA (portant un mutant nul de PNPase/Lmo1331). La complémentation de la PNPase a été obtenue par clonage d'un fragment PCR contenant la séquence totale de l'ORF pnpA avec 343 bps en amont et 162 bps en aval (amorces pPL2-pnpA-BamHI et pPL2-pnpA-SalI) dans le vecteur pPL2 après intégration dans la souche mutante ΔpnpA, résultant en la souche complémentée ΔpnpA :: pnpA35. Les souches ont été cultivées en routine dans du milieu Brain Heart Infusion (BHI) (BD Difco™). Pour la croissance ΔpnpA :: pnpA, du chloramphénicol a été ajouté à une concentration finale de 10 μg/mL. La kanamycine a été incluse à 50 μg/mL lorsque les souches d'E. coli ou de L. monocytogenes portaient des dérivés de pTCV.

Deux lignées cellulaires humaines ont été utilisées : HeLa (ATCC® CCL-2™) et HepG2 (ATCC® HB-8065™). Les cellules ont été cultivées en routine jusqu'à 80-90% de confluence dans le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) (Biowest) avec une teneur élevée en glucose et en l-glutamine, complétée par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) (Biowest). HeLa (1 × 105 cellules/puits) et HepG2 (1 × 105 cellules/puits) ont été ensemencées dans des plaques de culture à 24 puits et incubées à 37 °C, dans une atmosphère à 5 % de CO2 pendant 24 h avant l'infection (48 h pour HepG2). Le protocole de test d'internalisation a été adapté de la réf. 40. En bref, les suspensions bactériennes ont été diluées à la multiplicité d'infection (MOI) indiquée, ajoutées aux cellules et incubées pendant 1 h à 37 °C. Après cela, du DMEM avec de la gentamicine (40 μg/mL) a été ajouté et incubé pendant 1 h à 37 °C. Après lavage, les cellules humaines ont été lysées avec du Triton X-100 à 0,1 % (v/v) et des dilutions en série ont été effectuées pour déterminer le nombre de bactéries intracellulaires récupérées, exprimées en unités formant colonies par mL (CFU/mL).

Les images ont été acquises sur un microscope droit Leica DM 6000B équipé d'une caméra Andor iXon 885 EMCCD et contrôlées avec le logiciel MetaMorph V5.8 (Molecular Devices LLC), en utilisant l'objectif à immersion dans l'huile 100 × 1,4 NA plus un optivar 1,6 × et l'optique à contraste de phase. Le traitement des images a été effectué à l'aide du logiciel Fiji. Les images non recadrées sont fournies dans la Fig. 1 supplémentaire.

Les images des macrocolonies ont été acquises sur un stéréomicroscope Zeiss Axio Zoom.V16 équipé d'une caméra mono CCD Zeiss Axiocam 503 et contrôlés avec le logiciel Zeiss Zen 2.1 (édition bleue) (Zeiss), en utilisant l'objectif 1 × 0,25 NA et l'optique Bright Field. Le traitement des images a été effectué à l'aide du logiciel Fiji. Pour la détermination de la motilité natatoire, une suspension bactérienne à DO600 ∼ 0,7 a été inoculée sur des plaques de gélose molle BHI (gélose à 0,3 % (p/v)). Les plaques ont été incubées vers le haut à 25 ° C pendant 48 h et ont été photographiées à l'aide de la fonction Epi-white sur Gel Doc XR (Bio-Rad) (Fig. 2 supplémentaire).

Les cultures cultivées pendant la nuit ont été lavées une fois dans du BHI frais, diluées à 1:100 et 500 µL ont été ajoutés à chaque puits d'une plaque à 24 puits. Les plaques ont été incubées pendant 48 h à 37 °C, dans des conditions statiques. Après incubation, les biofilms ont été lavés avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco 1 × sans Ca2+/Mg2+ (DPBS) (Biowest) et séchés à 37 °C, suivis de l'ajout d'une solution de cristal violet à 0,1 % (p/v). La plaque a été lavée et après avoir été complètement sèche, elle a été numérisée à l'aide d'Image Scanner III (GE). Pour quantifier la biomasse de chaque biofilm, de l'acide acétique à 33% (v/v) a été ajouté pour solubiliser le CV et A595 a été mesuré à l'aide d'un spectrophotomètre (BioPhotometer plus, Eppendorf).

Des lamelles rondes stériles ont été placées dans chaque puits de la plaque à 24 puits et les suspensions bactériennes ont été préparées comme décrit dans "Biofilm formation assay". Après une incubation de 48 h à 37 °C, les biofilms ont été lavés avec du DPBS. Ensuite, ils ont été fixés avec la solution de fixation (glutaraldéhyde 2,5 % (v/v), formaldéhyde 1 % et tampon cacodylate 0,1 M, pH 7,4) et lavés avec du tampon cacodylate 0,1 M. Les échantillons ont été progressivement déshydratés en utilisant des concentrations croissantes d'éthanol (50%, 70%, 90%, 100%), et enfin de l'alcool tert-butylique a été ajouté pendant 2 h, suivi d'une congélation à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure. Les échantillons ont été lyophilisés sous vide et conservés à température ambiante jusqu'à ce que les analyses SEM aient été effectuées. Les échantillons ont été recouverts d'or (∼6 nm d'épaisseur) à l'aide d'une pulvérisation électronique (Cressington 108) pendant 15 s à 10 mA et imagés dans un microscope électronique à balayage Hitachi SU8010, à 1,5 kV pour un WD de 6 mm.

Les biofilms ont été formés pendant 48 h sur des lamelles rondes en verre stériles, puis lavés avec du DPBS. Pour observer l'épaisseur du biofilm, les biofilms ont été colorés avec 3 µM de colorant fluorescent SYTO ™ 9 (Thermo Fisher Scientific) et les images ont été acquises par le CLSM à l'aide de la ligne laser Ar + 488 nm (émission collectée à 500–590 nm) et des piles z à balayage à une taille de pas de balayage de 1,5 µm. Pour observer l'ADN extracellulaire et les cellules bactériennes de la matrice du biofilm, SYTO™ 9 (Thermo Fisher Scientific) à 3 µM dans du DPBS a été ajouté en premier, suivi du colorant fluorescent TO-PRO™-3 iodure (Thermo Fisher Scientific) à 4 µM dans du DPBS45. Les images ont été acquises à l'aide de la ligne laser Ar + 488 nm (émission collectée à 500–590 nm) et de la ligne laser He – Ne 633 nm (émission collectée à 645–795 nm), respectivement. Le colorant FilmTracer™ SYPRO® Ruby Biofilm Matrix (Thermo Fisher Scientific) a été utilisé pour la coloration des protéines47. Les images ont été acquises à l'aide de la ligne laser Ar+ 476 nm (émission collectée à 600-740 nm). Le complexe rouge de ruthénium-phénanthroline (RR-OP) a été utilisé pour colorer les polysaccharides dans la structure du biofilm. La synthèse du complexe RR-OP a suivi un protocole modifié par Bertolesi et al.50. Brièvement, 20 mg de rouge de ruthénium (RR) ont été dissous dans 10 ml d'eau distillée, puis 10 mg de 1,10-phénanthroline (OP) ont été ajoutés à la solution. Ensuite, le mélange a été chauffé à 100°C pendant 50 min. Le complexe a été obtenu sous la forme d'une solution vert foncé, qui a ensuite été utilisée pour colorer les biofilms à 2 mg/mL. Les images ont été acquises à l'aide de la ligne laser Ar+ 458 nm (émission collectée à 490–625 nm). Dans tous les cas, un microscope inversé Leica TCS SP5 avec un objectif apochromatique à eau 63× (ouverture numérique 1,2) a été utilisé. Les images ont été collectées avec 512 × 512 pixels à une fréquence de balayage de 100 Hz, à l'exception des mesures de la pile z qui ont été effectuées à 200 Hz. Des images tridimensionnelles des biofilms ont été construites à l'aide du logiciel Imaris (Bitplane). La biomasse du biofilm, l'épaisseur maximale et le coefficient de rugosité ont été quantifiés à partir des z-stacks à l'aide du logiciel COMSTAT83.

Une adaptation de la méthode de quantification décrite précédemment par Combrouse et al.84 a été suivie pour l'extraction et la quantification des composants de la matrice du biofilm. Après avoir collecté les biofilms, chaque suspension a été soniquée sur de la glace à l'aide d'un sonicateur à sonde (UP 200 s, Dr. Hielscher GmbH). Après sonication, la DO600 a été mesurée pour une normalisation supplémentaire et les suspensions ont été centrifugées à 3100 × g pour collecter les surnageants pour la quantification. La concentration de polysaccharides dans la matrice du biofilm a été déterminée par la méthode phénol-acide sulfurique, en utilisant le glucose comme étalon85,86. Les concentrations en protéines ont été quantifiées à l'aide du réactif de Bradford87 (Bio-Rad), avec de l'albumine de sérum bovin comme standard. L'ADN extracellulaire de la matrice du biofilm a été obtenu par la méthode d'extraction au phénol-chloroforme88 et la concentration a été déterminée à l'aide de NanoDropOnec (Thermo Fisher Scientific).

Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) de la gentamicine et de l'érythromycine dans les souches mutantes de type sauvage et ΔpnpA ont été déterminées à l'aide d'une adaptation de la méthode de microdilution en bouillon double dans des plaques de microtitration avec BHI à 37 ° C. La CMI a été déterminée par la plus faible concentration de croissance bactérienne inhibant les antibiotiques. Pour les tests d'éradication, après lavage, les solutions antibiotiques (en BHI) ont été ajoutées à des biofilms de 48 h et incubées pendant 24 h à 37 °C. Ensuite, chaque puits a été lavé avec du DPBS stérile, suivi d'une sonication dans un bain à ultrasons pendant 5 min. Le biofilm a été retiré et récupéré et des dilutions en série ont été effectuées dans du DPBS stérile et étalées dans des plaques de gélose BHI. Les UFC/mL ont été évaluées après une nuit d'incubation à 37 °C.

Les biofilms ont été lavés avec du DPBS, suivi de l'ajout de tampon A (glucose à 10 % (v/v), Tris 12,5 mM pH 7,5, EDTA 10 mM dans H2O) dans chaque puits et le biofilm a été collecté. La lyse cellulaire a été réalisée sur FastPrep®-24 (MP Bio) suivie d'une méthode au phénol-chloroforme et d'une précipitation à l'éthanol35. La Turbo DNase (Thermo Fisher Scientific) a été utilisée pour éliminer l'ADN génomique. La qualité et l'intégrité de l'ARN ont été analysées par électrophorèse sur gel d'agarose et sur Qubit™ 4 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific).

Des échantillons d'ARN total de deux réplicats biologiques de souches mutantes de type sauvage et ΔpnpA ont été séquencés à STAB VIDA (Portugal) avec une plate-forme Illumina HiSeq 4000 (extrémité appariée, longueur de lecture de 150 pb, lectures de 20 M). La construction de la bibliothèque d'ADNc a été réalisée à l'aide du kit de préparation de la bibliothèque Kapa RNA Hyper Prep avec QIA FastSelect -5S/16 S/23 S rRNA depletion. Les données d'ARN-seq ont été analysées selon le flux de travail décrit dans Pobre et Arraiano89. Les lectures ont été cartographiées par rapport au génome de L. monocytogenes (NC_003210.1 téléchargé à partir de la base de données du génome NCBI) à l'aide du programme Bowtie2. La visualisation des données a été réalisée avec Artemis Genome Browser. L'analyse de l'expression différentielle a été effectuée avec le package R edgeR. Nous avons considéré tous les transcrits avec une correction du taux de fausses découvertes (FDR) de la valeur P inférieure à 0,1 comme significatifs et nous avons ensuite filtré nos résultats en utilisant les valeurs d'expression (log2 CPM) supérieures à 3 et un changement de facteur entre deux échantillons supérieur à 2. En raison du petit nombre de répliques biologiques pour chaque souche, nous avons opté pour l'utilisation d'une correction FDR modérée de la valeur P inférieure à 0,1 au lieu d'une valeur plus stricte de 0,05 pour éviter la sous-estimation des DEG. L'annotation fonctionnelle a été réalisée avec l'outil d'annotation fonctionnelle DAVID.

L'ADNc a été synthétisé à partir de 1 µg d'ARN purifié à l'aide du kit de synthèse d'ADNc SensiFAST™ (Bioline). La transcription inverse couplée à une PCR quantitative (qPCR) a été réalisée avec un système Real Time Thermal Cycler qTower (Analytik Jena) et en utilisant le kit SensiFAST SYBR No-ROX (Bioline) selon les instructions du fournisseur. Les amorces pour qPCR sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 3. La quantification relative de l'expression génique a été calculée avec la méthode 2-ΔΔCt et en utilisant gyrA (lmo0007) comme gène de référence domestique.

Pour déterminer les stabilités de l'ARN, les cultures bactériennes ont été cultivées en phase stationnaire (OD600 ∼ 3) dans du milieu BHI à 37 ° C, sous agitation. La transcription a été bloquée en ajoutant de la rifampicine à une concentration finale de 500 µg/mL. Le point temporel zéro a été collecté juste avant l'ajout de rifampicine. Des échantillons de culture ont été prélevés à des moments définis et mélangés avec 0,2 volume de tampon d'arrêt d'ARN (solution de phénol acide: éthanol 1:20), suivis d'une centrifugation et d'une congélation instantanée. Après remise en suspension des culots dans le tampon A, la lyse cellulaire a été effectuée sur FastPrep®-24 (MP Bio), suivie d'une extraction au phénol-chloroforme et d'une précipitation à l'éthanol. Pour l'analyse par Northern blot, 10 à 40 µg d'ARN total ont été fractionnés dans un gel dénaturant au formaldéhyde d'agarose à 1 % dans un tampon MOPS. Les ARN ont été transférés sur une membrane Hybond-N+ (Cytiva) et réticulés aux UV par irradiation UV en utilisant un appareil UVC 500 (Amersham Biosciences). Les sondes oligonucléotidiques d'ADN ont été marquées avec du [y-32P]-ATP (PerkinElmer) à l'extrémité 5' en utilisant la polynucléotide kinase T4 (Thermo Fisher Scientific). Les sondes radiomarquées ont été purifiées sur des colonnes G25 Microspin (Cytiva). Les membranes ont été hybridées dans le tampon d'hybridation PerfectHyb Plus (Sigma-Aldrich) à 42 ° C, pendant une nuit, et analysées à l'aide du scanner FUJI TLA-5100 (Fujifilm). Les demi-vies de l'ARN ont été déterminées par régression linéaire en utilisant le logarithmique du pourcentage d'ARN restant en fonction du temps, en considérant la quantité d'ARN à 0 min comme 100 %. Des images non traitées des transferts Northern sont fournies dans les Figs supplémentaires. 3 et 4. Les sondes oligonucléotidiques utilisées dans ce travail sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 3.

Pour construire les vecteurs de fusion transcriptionnelle Plmo0048-lacZ et Plmo2006-lacZ, la région promotrice de chaque gène a été amplifiée par PCR avec les paires d'amorces appropriées (tableau supplémentaire 3). Le produit de PCR a été digéré avec EcoRI et BamHI (Thermo Fisher Scientific) et inséré dans le site correspondant du vecteur d'expression basé sur pTCV à faible nombre de copies portant E. coli lacZ (pTCV-lacZ)54 sans promoteur. Les constructions plasmidiques résultantes ont été transformées dans E. coli S17-1, qui a été utilisé pour la conjugaison90 avec L. monocytogenes EGD-e WT et le mutant isogénique ΔpnpA.

L'activité du promoteur a été analysée en mesurant l'activité β-galactosidase à l'aide du plasmide pTCV54. Les cellules ont été cultivées jusqu'à la phase stationnaire (OD600 ∼ 3) dans du milieu BHI à 37°C, avec agitation. Les échantillons collectés (1 ml) ont été centrifugés et les culots ont été congelés rapidement. Les culots ont été remis en suspension dans 1 ml de tampon Z (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4, 50 mM β-mercaptoéthanol, pH 7,0) et la DO600 a été mesurée. Les cellules ont été perméabilisées avec du toluène à 0,5 % et de l'éthanol à 4,5 % pendant 5 min à 30 °C dans un bain-marie. Pour déterminer l'activité β-galactosidase, 200 µL de tampon Z contenant 4 mg/mL d'o-nitrophényl-β-d-galactopyranoside (ONPG, Sigma-Aldrich) ont été ajoutés à chaque échantillon, suivis d'une incubation à 30 °C dans un bain-marie. Les réactions ont été arrêtées en ajoutant 500 µL de NaCO3 1 M, et le temps a été enregistré. L'absorbance à 420 nm a été mesurée après centrifugation pendant 5 min à 21 000 × g. L'activité β-galactosidase (unités Miller) a été calculée comme (1000 × A420)/(T × V × OD600). T, temps de réaction (en minutes) ; V, volume de bactéries (en mL).

Pour l'extraction totale des protéines, les cultures bactériennes ont été cultivées en phase stationnaire (OD600 ∼ 3) dans du milieu BHI à 37 ° C, avec agitation, suivie d'une centrifugation. La lyse cellulaire a été effectuée sur FastPrep®-24 (MP Bio) et l'extrait protéique a été récupéré du surnageant. La quantification des protéines a été effectuée en utilisant le réactif de Bradford, comme ci-dessus.

Les échantillons de protéines ont été chargés dans un gel Bolt ™ 4–12% Bis-Tris Plus (Invitrogen ™) avec un tampon MOPS 1X additionné d'antioxydant Bolt ™ (0,25%) et un système Mini Gel Tank (Invitrogen ™) a été utilisé. Le transfert sur des membranes de nitrocellulose a été réalisé en utilisant le Mini Blot Module (Invitrogen™). Pour la détection des protéines, les membranes ont été bloquées pendant 1 h avec une solution de blocage (TBS + 0,1 % de Tween-20 (TBS-T) + 5 % de lait en poudre écrémé) et incubées pendant une nuit à 4 °C avec les anticorps primaires suivants : lapin α-InlA 1:5000 (Cusabio) ou lapin α-EF-Tu 1:40000 (Abcam) dans TBS-T. L'anticorps secondaire chèvre α-lapin IgG-HRP 1:20 000 (Sigma) a été incubé pendant 1 h à 4 °C. La détection a été effectuée par chimiluminescence à l'aide du substrat de chimiluminescence amélioré Western Lightning® Plus-ECL (PerkinElmer) dans le système d'imagerie iBright ™ CL1500 (Fig. 5 supplémentaire). Les images ont été quantifiées à l'aide du logiciel Fiji.

Les données expérimentales ont été analysées à l'aide de GraphPad Prism version 8.0.1 (logiciel GraphPad). Le test t de Student a été utilisé pour déterminer la signification statistique de la plupart des expériences. Une comparaison entre le traitement antibiotique et le contrôle a été effectuée à l'aide d'une ANOVA à deux facteurs. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type (SD) ou de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Une valeur de PA <0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données discutées dans cette publication ont été déposées dans Gene Expression Omnibus du NCBI et sont accessibles via le numéro d'accession GEO Series GSE210097.

da Silva, RAG, Afonina, I. & Kline, KA Éradiquer les infections par biofilm : une mise à jour sur les approches actuelles et prospectives. Courant. Avis. Microbiol. 63, 117-125 (2021).

Article PubMed Google Scholar

Penesyan, A., Paulsen, IT, Kjelleberg, S. & Gillings, MR Trois visages des biofilms : un mode de vie microbien, un organisme multicellulaire naissant et un incubateur de diversité. NPJ Biofilms Microbiomes 7, 1–9 (2021).

Article Google Scholar

Vestby, LK, Grønseth, T., Simm, R. & Nesse, LL Biofilm bactérien et son rôle dans la pathogenèse de la maladie. Antibiotiques 9, 59 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shi, X. & Zhu, X. Formation de biofilm et sécurité alimentaire dans les industries alimentaires. Tendances Food Sci. Technol. 20, 407–413 (2009).

Article CAS Google Scholar

Sauer, K. et al. Le cycle de vie du biofilm : élargir le modèle conceptuel de la formation du biofilm. Nat. Rév. Microbiol. 20, 608–620 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Flemming, HC & Wingender, J. La matrice du biofilm. Nat. Rév. Microbiol. 8, 623–633 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar

Jefferson, KK Qu'est-ce qui pousse les bactéries à produire un biofilm ? Microbiol FEMS. Lett. 236, 163–173 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hall, CW & Mah, TF Mécanismes moléculaires de la résistance et de la tolérance aux antibiotiques à base de biofilm chez les bactéries pathogènes. Microbiol FEMS. Rév. 41, 276–301 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Autorité européenne de sécurité des aliments et Centre européen de prévention et de contrôle des maladies. Le rapport sur les zoonoses One Health 2019 de l'Union européenne. EFSA J. 19, 6406 (2021).

Radoshevich, L. & Cossart, P. Listeria monocytogenes : vers une image complète de sa physiologie et de sa pathogenèse. Nat. Rév. Microbiol. 16, 32–46 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gandhi, M. & Chikindas, ML Listeria : un agent pathogène d'origine alimentaire qui sait survivre. Int. J. Microbiol Alimentaire. 113, 1–15 (2007).

Article PubMed Google Scholar

Ferreira, V., Wiedmann, M., Teixeira, P. & Stasiewicz, MJ Listeria monocytogenes persistance dans les environnements associés à l'alimentation : épidémiologie, caractéristiques des souches et implications pour la santé publique. J. Aliment Prot. 77, 150-170 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gray, J. et al. Dynamique de colonisation des souches de Listeria monocytogenes isolées des environnements de production alimentaire. Sci. Rep. 11, 1–17 (2021).

Article Google Scholar

Lee, BH et al. Formation de biofilms de souches de Listeria monocytogenes dans des environnements de transformation des aliments et étude d'association pangénomique. Devant. Microbiol. 10, 1–18 (2019).

Article Google Scholar

Bai, X. et al. Les Listeria monocytogenes isolées dans un biofilm présentent une dissémination systémique réduite au stade précoce (12 à 24 h) de l'infection dans un modèle murin. NPJ Biofilms Microbiomes 7, 1–16 (2021).

Article CAS Google Scholar

Chae, MS & Schraft, H. Évaluation comparative de l'adhésion et de la formation de biofilms de différentes souches de Listeria monocytogenes. Int. J. Microbiol Alimentaire. 62, 103–111 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar

Guilbaud, M., Piveteau, P., Desvaux, M., Brisse, S. & Briandet, R. Exploration de la diversité de l'architecture du biofilm de Listeria monocytogenes par microscopie confocale à balayage laser à haut débit et la prédominance du morphotype en nid d'abeille. Appl. Environ. Microbiol. 81, 1813–1819 (2015).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Rieu, A. et al. Biofilms de Listeria monocytogenes EGD-e : pas de champignons mais un réseau de chaînes tricotées. Appl. Environ. Microbiol. 74, 4491–4497 (2008).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lemon, KP, Higgins, DE & Kolter, R. La motilité flagellaire est essentielle à la formation de biofilm de Listeria monocytogenes. J. Bactériol. 189, 4418–4424 (2007).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rieu, A., Weidmann, S., Garmyn, D., Piveteau, P. & Guzzo, J. système agr de Listeria monocytogenes EGD-e : rôle dans l'adhérence et le modèle d'expression différentiel. Appl. Environ. Microbiol. 73, 6125–6133 (2007).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zetzmann, M. et al. Caractérisation du phénotype du biofilm d'un mutant Listeria monocytogenes déficient en agr peptide sensing. Microbiologieouvert 8, 1–9 (2019).

Article Google Scholar

Hsu, CY et al. Les différences génomiques entre les isolats de Listeria monocytogenes EGDe révèlent des rôles cruciaux pour SigB et la rhamnosylation de la paroi dans la formation de biofilm. J. Bactériol. 202, 1–13 (2020).

Article Google Scholar

Lemon, KP, Freitag, NE & Kolter, R. Le régulateur de virulence PrfA favorise la formation de biofilm par Listeria monocytogenes. J. Bactériol. 192, 3969-3976 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Travier, L. et al. ActA favorise l'agrégation de Listeria monocytogenes, la colonisation intestinale et le portage. PLoS Pathog. 9, e1003131 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Van Der Veen, S. & Abee, T. Importance de SigB pour la formation de biofilm statique et à flux continu de Listeria monocytogenes et la résistance aux désinfectants. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7854–7860 (2010).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Dramsi, S. et al. L'entrée de Listeria monocytogenes dans les hépatocytes nécessite l'expression de inlb, une protéine de surface de la famille multigénique des internalines. Mol. Microbiol. 16, 251-261 (1995).

Article CAS PubMed Google Scholar

Mika, F. & Hengge, R. Petits ARN régulateurs dans le contrôle de la motilité et de la formation de biofilms chez E. coli et Salmonella. Int. J. Mol. Sci. 14, 4560–4579 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Parker, A., Cureoglu, S., De Lay, N., Majdalani, N. & Gottesman, S. Voies alternatives pour la formation de biofilm d'Escherichia coli révélées par la surproduction d'ARNs. Mol. Microbiol. 105, 309–325 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Condinho, M. et al. Le rôle des régulateurs d'ARN, du quorum sensing et du c-di-GMP dans la formation de biofilms bactériens. FEBS Open Bio. 1–17 https://doi.org/10.1002/2211-5463.13389 (2022).

Lim, B., Beyhan, S., Meir, J. & Yildiz, FH Systèmes de transduction de signaux cycliques-diGMP dans Vibrio cholerae : modulation de la rugosité et de la formation de biofilms. Mol. Microbiol. 60, 331–348 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

dos Santos, RF et al. Exoribonucléases 3′–5′ majeures dans le métabolisme des ARN codants et non codants. Programme. Mol. Biol. Trad. Sci. 159, 101–155 (2018).

Article PubMed Google Scholar

Hu, J. & Zhu, M.-JJ Les défauts de la polynucléotide phosphorylase altèrent la virulence chez Escherichia coli O157:H7. Devant. Microbiol. 6, 1–9 (2015).

Article Google Scholar

Chen, R. et al. La polynucléotide phosphorylase régule plusieurs facteurs de virulence et la stabilité des petits ARN RsmY/Z chez Pseudomonas aeruginosa. Devant. Microbiol. 7, 1–12 (2016).

Google Scholar

Rosenzweig, JA & Chopra, AK L'exoribonucléase polynucléotide phosphorylase influence la virulence et les réponses au stress des yersiniae et de nombreux autres agents pathogènes. Devant. Cellule. Infecter. Microbiol. 3, 81 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sesto, N. et al. Un système CRISPR dépendant de PNPase dans Listeria. PLoS Genet. 10, e1004065 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Rouf, SF et al. Contributions opposées de la polynucléotide phosphorylase et de la protéine membranaire Nlpi à la formation de biofilm par Salmonella enterica sérovar Typhimurium. J. Bactériol. 193, 580-582 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Saramago, M., Domingues, S., Viegas, SC et Arraiano, CM La formation de biofilms et la résistance aux antibiotiques chez Salmonella Typhimurium sont affectées par différentes ribonucléases. J. Microbiol. Biotechnol. 24, 8-12 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Pobre, V. & Arraiano, CM L'analyse de séquençage de nouvelle génération révèle que les ribonucléases RNase II, RNase R et PNPase affectent la motilité bactérienne et la formation de biofilm dans E. coli. BMC Genomics 16, 72 (2015).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Carzaniga, T., Antoniani, D., Dehò, G., Briani, F. & Landini, P. L'enzyme de traitement de l'ARN polynucléotide phosphorylase contrôle négativement la formation de biofilm en réprimant la production de poly-N-acétylglucosamine (PNAG) dans Escherichia coli C. BMC Microbiol. 12, 270 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kühbacher, A., Cossart, P. & Pizarro-Cerdá, J. Essais d'internalisation pour Listeria monocytogenes. dans Listeria monocytogenes—Méthodes et protocoles (eds Jordan, K., Fox, EM & Wagner, M.) Vol. 1157, 167-178 (Springer New York, 2014).

Josenhans, C. & Suerbaum, S. Le rôle de la motilité en tant que facteur de virulence chez les bactéries. Int. J. Med. Microbiol. 291, 605–614 (2002).

Article CAS PubMed Google Scholar

Yang, DC, Blair, KM & Salama, NR Rester en forme : l'impact de la forme des cellules sur la survie des bactéries dans divers environnements. Microbiol. Mol. Biol. Rév. 80, 187–203 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Serra, DO, Richter, AM, Klauck, G., Mika, F. & Hengge, R. Microanatomie à résolution cellulaire et ordre spatial de différenciation physiologique dans un biofilm bactérien. MBio 4, e00103–13 (2013).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Martín‐Rodríguez, AJ et al. Régulation de la morphologie des colonies et de la formation de biofilms chez les algues Shewanella. Microb. Biotechnol. 14, 1183-1200 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Pinto, SN et al. Le mécanisme d'action de pepR, un peptide d'origine virale, contre les biofilms de Staphylococcus aureus. J. Antimicrobe. Chimimère. 74, 2617-2625 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Colagiorgi, A., Di Ciccio, P., Zanardi, E., Ghidini, S. & Ianieri, A. Un aperçu de la matrice extracellulaire des biofilms de Listeria monocytogenes. Micro-organismes 4, 22 (2016).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Loza-Correa, M. et al. La matrice de peptidoglycane et de biofilm de Staphylococcus epidermidis subit des modifications structurelles lorsqu'elle est exposée aux plaquettes humaines. PLoS ONE 14, 1–18 (2019).

Article Google Scholar

Skogman, ME, Vuorela, PM & Fallarero, A. Combinaison des mesures de matrice de biofilm avec des analyses de biomasse et de viabilité dans les évaluations de sensibilité des antimicrobiens contre les biofilms de Staphylococcus aureus. J. Antibiot. 65, 453–459 (2012).

Article CAS Google Scholar

Borucki, MK, Peppin, JD, White, D., Loge, F. & Call, DR Variation de la formation de biofilms parmi les souches de Listeria monocytogenes. Appl. Environ. Microbiol. 69, 7336–7342 (2003).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bertolesi, GE, de Cidre, LL & Stockert, JC Formation et application microscopique d'un dérivé fluorescent de 1,10-phénanthroline de rouge de ruthénium. Acta Histochem. 97, 401–408 (1995).

Article CAS PubMed Google Scholar

Allerberger, F. & Wagner, M. Listériose : une infection d'origine alimentaire résurgente. Clin. Microbiol. Infecter. 16, 16–23 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar

Temple, ME & Nahata, MC Traitement de la listériose. Ann. Pharmacologue. 34, 656–661 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar

Jaishankar, J. & Srivastava, P. Base moléculaire de la survie en phase stationnaire et applications. Devant. Microbiol. 8, 2000 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Poyart, C. & Trieu-Cuot, P. Un vecteur navette mobilisable à large gamme d'hôtes pour la construction de fusions transcriptionnelles à la bêta-galactosidase dans des bactéries gram-positives. Microbiol FEMS. Lett. 156, 193-198 (1997).

Article CAS PubMed Google Scholar

Autret, N., Raynaud, C., Dubail, I., Berche, P. & Charbit, A. Identification du locus agr de Listeria monocytogenes : rôle dans la virulence bactérienne. Infecter. Immun. 71, 4463–4471 (2003).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Riedel, CU et al. La détection de quorum dépendante d'AgrD affecte la formation de biofilm, l'invasion, la virulence et les profils d'expression génique globale chez Listeria monocytogenes. Mol. Microbiol. 71, 1177-1189 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Postma, PW, Lengeler, JW & Jacobson, GR Systèmes de phosphoénolpyruvate: glucides phosphotransférases de bactéries. Microbiol. Rév. 57, 543–594 (1993).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jeckelmann, JM & Erni, B. Le système mannose phosphotransférase (Man-PTS) - transporteur et récepteur de mannose pour les bactériocines et les bactériophages. Biochim. Biophys. Acta Biomembre. 1862, 183412 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Erni, B. Le phosphoénolpyruvate bactérien : système sucre phosphotransférase (PTS) : une interface entre l'énergie et la transduction du signal. J. Iran. Chim. Soc. 10, 593–630 (2013).

Article CAS Google Scholar

Allan, RN et al. Changements métaboliques prononcés dans l'adaptation à la croissance du biofilm par Streptococcus pneumoniae. PLoS ONE 9, e107015 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Suriyanarayanan, T. et al. La protéomique quantitative des formateurs de biofilms forts et faibles d'Enterococcus faecalis révèle de nouveaux régulateurs de la formation de biofilms. Mol. Cellule. Protéome. 17, 643–654 (2018).

Article CAS Google Scholar

Gopal, S. et al. L'utilisation du maltose et de la maltodextrine par Listeria monocytogenes dépend d'un transporteur ABC inductible qui est réprimé par le glucose. PLoS ONE 5, e10349 (2010).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Deutscher, J. et al. Utilisation des glucides par Listeria monocytogenes et son influence sur l'expression des gènes de virulence. dans Listeria Monocytogenes: Food Sources, Prevalence and Management Strategies (ed. Hambrick, EC) 49–76 (Nova Science Pub Inc, 2014).

Koomen, J. et al. Phénotypage basé sur le profilage génétique pour l'identification des paramètres cellulaires qui contribuent à la forme physique, à la tolérance au stress et à la virulence des variants de Listeria monocytogenes. Int. J. Microbiol Alimentaire. 283, 14-21 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Noothalapati Venkata, HN, Nomura, N. & Shigeto, S. Piscines de leucine dans le biofilm d'Escherichia coli découvert par imagerie Raman. J. Raman Spectrosc. 42, 1913-1915 (2011).

Article Google Scholar

Valle, J. et al. L'acide aminé valine est sécrété dans des biofilms bactériens à flux continu. J. Bactériol. 190, 264-274 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bernier, SP, Ha, D.-G., Khan, W., Merritt, JH & O'Toole, GA Modulation des comportements de groupe associés à la surface de Pseudomonas aeruginosa par des acides aminés individuels via la signalisation c-di-GMP. Rés. Microbiol. 162, 680–688 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, Z. et al. L'intégration du transcriptome et du métabolome révèle les gènes et les métabolites impliqués dans la formation du biofilm de Bifidobacterium bifidum. Int. J. Mol. Sci. 22, 7596 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, Y. et al. Des mutations dans gltB et gltC réduisent la tolérance au stress oxydatif et la formation de biofilms chez Listeria monocytogenes 4b G. Int. J. Microbiol Alimentaire. 163, 223-230 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kimura, T. & Kobayashi, K. Rôle de la glutamate synthase dans la formation de biofilm par Bacillus subtilis. J. Bactériol. 202, 1–17 (2020).

Article Google Scholar

Wang, Y. et al. Analyse protéomique comparative des biofilms de Streptococcus suis et des cellules planctoniques qui ont identifié les protéines immunogènes liées à l'infection du biofilm. PLoS ONE 7, e33371 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Y. et al. pdh module la virulence en réduisant la tolérance au stress et la formation de biofilm de Streptococcus suis sérotype 2. Virulence 10, 588–599 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Andrade, JM, Pobre, V., Matos, AM & Arraiano, CM Le rôle crucial de la PNPase dans la dégradation des petits ARN non associés à Hfq. ARN 18, 844–855 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Quendera, AP et al. Protéines de liaison à l'ARN pilotant l'activité régulatrice des petits ARN non codants chez les bactéries. Devant. Mol. Biosci. 7, 1–9 (2020).

Article Google Scholar

Marujo, PE et al. La RNase II élimine les queues oligo(A) qui déstabilisent l'ARNm rpsO d'Escherichia coli. ARN 6, 1185–1193 (2000).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mengaud, J. et al. Contrôle pléiotropique des facteurs de virulence de Listeria monocytogenes par un gène autorégulé. Mol. Microbiol. 5, 2273-2283 (1991).

Article CAS PubMed Google Scholar

Luo, Q. et al. PrfA a entraîné une réduction de la formation de biofilm et a contribué à modifier les modèles d'expression génique dans les Listeria monocytogenes formant un biofilm. Courant. Microbiol. 67, 372–378 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Janež, N., Škrlj, B., Sterniša, M., Klančnik, A. & Sabotič, J. Le rôle du surfactome de Listeria monocytogenes dans la formation de biofilm. Microb. Biotechnol. 14, 1269-1281 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Camara, M. et al. Importance économique des biofilms : un défi multidisciplinaire et intersectoriel. NPJ Biofilms Microbiomes 8, 1–8 (2022).

Article Google Scholar

Martínez, LC & Vadyvaloo, V. Mécanismes de régulation génique post-transcriptionnelle dans les biofilms bactériens. Devant. Cellule. Infecter. Microbiol. 5, 1–15 (2014).

Google Scholar

Oliva, G., Sahr, T. & Buchrieser, C. Petits ARN, éléments 5' UTR et protéines de liaison à l'ARN chez les bactéries intracellulaires : impact sur le métabolisme et la virulence. Microbiol FEMS. Rév. 39, 331–349 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Christopoulou, N. & Granneman, S. Le rôle des protéines de liaison à l'ARN dans la médiation des réponses adaptatives chez les bactéries Gram-positives. FEBS J. 289, 1746–1764 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Heydorn, A. et al. Quantification des structures du biofilm par le nouveau programme informatique COMSTAT. Microbiologie 146, 2395–2407 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar

Combrouse, T. et al. Quantification de la matrice extracellulaire des biofilms de Listeria monocytogenes de différentes lignées phylogéniques avec optimisation des conditions de culture. J. Appl. Microbiol. 114, 1120-1131 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Dubois, M., Gilles, KA, Hamilton, JK, Rebers, PA & Smith, F. Méthode colorimétrique pour la détermination des sucres et des substances apparentées. Anal. Chim. 28, 350–356 (1956).

Article CAS Google Scholar

Nakamura, H., Takakura, KI, Sone, Y., Itano, Y. & Nishikawa, Y. Formation de biofilm et résistance au chlorure de benzalkonium chez Listeria monocytogenes isolé d'une usine de transformation du poisson. J. Aliment Prot. 76, 1179-1186 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bradford, MM Une méthode rapide et sensible pour la quantification de microgrammes de protéines utilisant le principe de la liaison protéine-colorant. Anal. Biochimie. 72, 248-254 (1976).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sambrook, J. & Russell, DW Purification des acides nucléiques par extraction au phénol:chloroforme. Cold Spring Harb. Protocole 2006, pdb.prot4455 (2006).

Article Google Scholar

Pobre, V. & Arraiano, CM Caractérisation du rôle des exoribonucléases dans le contrôle de l'expression des gènes microbiens : ARN différentiel-Seq. Méthodes Enzymol. 612, 1–24 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lauer, P., Chow, MYN, Loessner, MJ, Portnoy, DA & Calendar, R. Construction, caractérisation et utilisation de deux vecteurs d'intégration de phages spécifiques au site Listeria monocytogenes. J. Bactériol. 184, 4177–4186 (2002).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Télécharger les références

Ce travail a été soutenu par FCT-Fundação para a Ciência ea Tecnologia, IP, par l'intermédiaire de : MOSTMICRO-ITQB R&D Unit (UIDB/04612/2020, UIDP/04612/2020) ; Laboratoire associé LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) ; Accorder PTDC/BIA-MIC/32525/2017 à JMA ; Bourse doctorale à l'APQ (PD/BD/135487/2018); Contrats FCT selon DL57/2016 à SNP (SFRH/BPD/92409/2013) et à VP (SFRH/BPD/87188/2012).

Institut António Xavier de technologie chimique et biologique, Nouvelle Université de Lisbonne (ITQB NOVA), Avenida da República, 2780-901, Oeiras, Portugal

Ana Patrícia Quendera, Vânia Pobre, Cecília Maria Arraiano & José Marques Andrade

Institut de bioingénierie et de biosciences (IBB) et laboratoire associé - Institut de santé et de bioéconomie (i4HB), Instituto Superior Técnico, Université de Lisbonne, Av. Rovisco País, 1049-001, Lisbonne, Portugal

Sandra Nunes Pinto & Basco DB Boniface

Laboratoire d'Imagerie, Nanomorphologie et Spectroscopie X (Linx) du Laboratoire Militaire de l'Unité de Défense Biologique et Chimique (UMLDBQ), Institut Universitaire Militaire, Centre de Recherche, d'Innovation et de Développement de l'Académie Militaire, Av. Dr Alfredo Bensaúde, 1100-471, Lisbonne, Portugal

Wilson Antunes

Département de bioingénierie, Instituto Superior Técnico, Université de Lisbonne, Av. Rovisco País, 1049-001, Lisbonne, Portugal

Basque DB Boniface

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

JMA a conçu le projet ; APQ, SNP et JMA ont conçu l'étude ; CMA et JMA ont co-supervisé les travaux de l'APQ ; APQ, SNP, WA, VDBB et JMA ont réalisé des expériences ; APQ, SNP, VP et JMA ont analysé les données ; JMA s'est chargé de l'administration du projet et de l'acquisition des fonds ; APQ et JMA ont écrit l'article. Tous les auteurs ont contribué à la discussion, à la révision et à l'édition de la version finale du manuscrit.

Correspondance à José Marques Andrade.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International License, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, tant que vous donnez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Quendera, AP, Pinto, SN, Pobre, V. et al. La ribonucléase PNPase est un régulateur clé de la formation de biofilm chez Listeria monocytogenes et affecte l'invasion des cellules hôtes. npj Biofilms Microbiomes 9, 34 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00397-1

Télécharger la citation

Reçu : 25 octobre 2022

Accepté : 18 mai 2023

Publié: 07 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41522-023-00397-1

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt